NMR

Nuclear Magnetic Resonance (NMR) er en spektroskopisk teknikk som brukes til å fremkalle molekylenes strukturelle og dynamiske egenskaper ved å utnytte hvordan enkelte atomer oppfører seg når de plasseres i sterke, superledende magneter (180.000 til 360.000 sterkere enn jordens magnetfelt for magneter ved UConn Health). Når NMR-aktive kjerner plasseres i et sterkt magnetfelt vil kjernene rette seg inn i feltet og aktivere seg med en frekvens som avhenger av isotopens gyromagnetiske forhold og styrken i magnetfeltet, i tillegg til det kjemiske og fysiske miljøet rundt atomet. Den frekvenskomponenten som avhenger av det kjemiske og fysiske miljøet kalles det kjemiske skiftet. NMR-eksperimenter forstyrrer denne innrettingen med korte, radiofrekvente (RF) energipulser for å bestemme det kjemiske skiftet for hvert av de NMR-aktive atomene i molekylet som studeres. Ved å bruke en kombinasjon av pulser og forsinkelser (dvs. en pulssekvens), kan det samles mer informasjon, som f.eks. hvilke atomer som er bundet til hverandre og hvilke atomer som ligger nær hverandre. Ved å gjøre mange forskjellig eksperimenter er det mulig å bestemme den tredimensjonale strukturen i molekylene, også for store bio-molekyler som proteiner.

Høyoppløselige NMR undersøkelser er bedre for proteiner med under 25 kDa i masse og løselige til omtrent 0,5 mM. I enkelte tilfeller er det mulig å undersøke proteiner eller komplekser med større størrelse eller lavere løselighet. Membranproteiner er vanskelige å studere med høyoppløselige metoder, men det begynner å komme ny teknikk som kan løse dette. Fordi NMR-studier vanligvis krever merking, må det finnes proteiner med stabile isotoper 15N, 13C og noen ganger 2H (et system tilpasset vekst i merket medium). Proteinene må være purifisert (typisk kreves > 95 %), foldet, og tilnærmet stabile. Foreløpig karakterisering med sirkulær dikroisme og termisk eller solvent denaturering anbefales.

Spørsmålet er vanskelig å besvare, for det avhenger av problemstillingen og prøvens egenskaper. Ofte vil prøver på 300 µl (med spesielle NMR-rør) til 600 µl kreves. Proteinkonsentrasjoner for systemer med gode egenskaper bør ligge over 150 µM for strukturelle studier, mens lavere konsentrasjoner kan brukes for andre, ikke-strukturelle studier. 150 µM er et grovt estimat for den laveste konsentrasjonen som kan brukes til strukturelle studie. Imidlertid anbefaler vi å bruke så høye proteinkonsentrasjoner som mulig - og de bør begrenses av løselighet og proteinegenskaper, ikke av mengden protein tilgjengelig. Tiden som brukes til å kjøre lengre eksperimenter for å kompensere for lave konsentrasjoner, og den ekstra tiden som trengs for å analysere NMR-spektrumer, vil helt sikker være lenger enn den tiden som trengs for å forberede en ekstra prøve.

Når prøven er tilstrekkelig purifisert og tørket, er neste sted å velge et passende løsningsmiddel. Siden den mest populære "lock nucleus" er deuterium, løses prøven vanligvis opp i et deutrert løsningsmiddel (et deutrert løsningsmiddel er et der en stor andel (typisk mer enn 99 %) av hydrogenatomene er byttet ut med deuterium). Vanlige deutrerte løsningsmidler er acetone-d6, benzene-d6 og chloroform-d, men det finnes mange andre typer løsningsmidler.

Viktige faktorer ved valg av løsningsmiddel:

1. Løselighet:

• Jo mer løselig prøven er, jo bedre er det. Det maksimerer mengden prøve i det sensitive volumet og øker sensitiviteten i eksperimentet. Høy løselighet er spesielt viktig hvis det bare er små mengder prøve tilgjengelig.

2. Interferens fra løsningsmiddelsignaler med samme spektrum

• Løsningsmiddelet selv vil uvegerlig produsere NMR signaler som dekker til deler av spektrum. Disse løsemiddelresidual-toppene må ikke overlappe med signaler fra prøven.

3. Temperaturavhengighet:

• For eksperimenter over eller under romtemperatur er løsningsmiddelets smelte- og kokepunkt også viktige faktorer. Løseligheten til prøven vil dessuten ofte variere med temperaturen.

4. Viskositet:

• Jo lavere viskositet i løsningsmiddelet, jo bedre oppløsning av eksperimentet.

5. Kostnad:

• Ved rutine-NMR, der mange prøver skal måles, er kostnaden for løsningsmidler selvfølgelig en viktig vurdering. Tommelfingerregelen er at prisen stiger med antallet deutrerte atomer.

6. Vanninnhold:

• De fleste NMR-løsningsmidler har spor av vann. Mange er også hygroskope (de absorberer vann fra atmosfæren) - det innebærer at jo lenger de lagres, jo mer vann vil de inneholde. Forekomst av en vanntopp (HDO) vil degradere kvaliteten på .NMR-spektrumet. Vannivået i løsningsmiddelet kan reduseres betydelig med filtrering gjennom en tørkemiddel eller ved å lagre løsningsmiddelet over en molekylær sikt.
• Valget av løsningsmiddel for en spesiell prøve vil til slutt bli et godt kompromiss mellom fordeler og ulemper for det enkelte middel. For flere opplysninger om spesielle løsningsmidler ber vi deg lese avsnittet om NMR.